Были изучен ряд свойств человеческих гиалуронидаз, находящихся в соматических тканях и в жидкостях тела. При анализе на ПААГ-гиалуронановом геле печень и плацента показали 7 форм гиалуронидазы, в то время как плазма и синовиальная жидкость представили 3 и 2 формы соответственно. Яичник, грудь, миометрий, оболочка матки, кожа, лейкоциты и тромбоциты показали различные образцы ферментативной микрополидисперсности. Самые окисленные формы находятся в синовиальной жидкости и плазме. Обработка сиалидазой сокращает число форм до 3-х в печени, 2-х в плаценте и к медленной канонической форме в сыворотке. Плазменные и плацентарные гиалуронидазы остаются полностью активными после тепловой обработки, но десиализованные гиалуронидазы медленно инактивируется в плазме и быстро в плаценте, предполагающей полное гликозилирование плазменного фермента более высокого порядка. Потенциальные участки N-гликозилирования были исследованы на предмет последовательностей аминокислот в гиалуронидазах у человека и других, относящихся и не относящихся к млекопитающим разновидностей. Потенциальный участок N-гликозилирования наблюдался в том же самом положении в человеческой плазме, человеческих лизосомах, человеческих Hyal-4 и Hyal-мн. Тот же самый участок также присутствовал в плазме мыши, мышиных лизосомах, лизосомах крысы, печени лягушки, у ос, шершней, в яде пчелы медоносной и у вида C. elegans. Однако этот участок отсутствовал в человеке Hyal-3, в человеческой менингиоме и во всей сперме исследованной на наличие гиалуронидазы. Второй потенциальный участок N-гликозилирования также присутствует во всех гиалуронидазах с идентичным образцом (Asn-Val-Thr; аспарагин - валин - треонин) за исключением таковых лизсомального происхождения (Asn-Val-Ser). Участок 2 отсутствует в яде пчелы медоносной и у С. elegans. Такие сохраненные участки позволяют уверенно предполагать, что они могут представлять участки N-гликозилирования.

Введение

Дюран-Рейнальс и Стюарт продемонстрировали, что экстракт, выделенный из тестикул кролика, содержит фактор, который увеличивает распространение вирусных агентов, и что этот фактор также присутствовал в эпителиальных органах, таких как печень, почки и кожа. Далее его назвали гиалуронидаза. Гиалуронидазы играют роль во многих биологических процессах, включая изменения, наблюдаемые в лизосомах и внеклеточном матриксе во время нормального и опухолевого деления клетки.

Гиалуронидазы составляют большую семью ферментов и широко представлены у многих видов в тканях и жидкостях тела. В предыдущем исследовании мы продемонстрировали полиморфизм гиалуронидазы у человека, мыши, крысы, хомяка, собаки и сыворотке тритоне рода cristatus. Но никакая активность гиалуронидазы не была обнаружена в сыворотках лошади, свиньи, рогатого скота, козы, овец, кролика, цыпленка, тритонов видов alpestris и palmatus, а также многих других видах. Существует много кислотных гидролаз, которые представлены в виде различных изоформ, отличающихся по их электрофоретической подвижности в зависимости от содержания в них сиаловой кислоты. Это вызвало интерес к данному исследованию на различных формах гиалуронидаз в телесных человеческих тканях и жидкостях тела. Это исследование также включает поиск потенциальных участков N-гликозилирования в гиалуронидазах у человека и других относящихся и не относящихся к млекопитающим видах.

Материалы & методы

Человеческие биологические образцы

Нормальная кровь и моча были предоставлены здоровыми донорами добровольно. Хирургические экземпляры ткани были от Больницы Кюри, Париж, Франция. Синовиальные жидкости из коленного сустава от полиподагрических пациентов были предоставлены Объединением 291 Инсерм, Лион, Франция.

Химические реактивы

ГК из человеческой пуповины H 1751, сиалидаза ЕС 3.2.1.18 типа III из холерного вибриона N 7885. Полимеризующий агент и комплект MW-ND-500 для маркеров молекулярной массы для того, чтобы не денатурировать гель для полиакриламидного электрофореза были от Sigma (St-Louis, MO, США) stains-all®, № 2718, были от Eastman-Kodak, (Рочестер, Нью-Йорк, США). Все другие химикаты были от Merck (Дармштадт, Германия).

Выделение тканей и биологические жидкости

Ткани из различных органов, лейкоцитов и тромбоцитов были гомогенизированы в 4-х объемах 0.1 % тритона X-100. Гомогенат был оставлен на 1 час при комнатной температуре и затем отцентрифугирован при 3000 g в течение 15 минут при 4°C. Супернатант был сконцентрирован, используя Aquacid, и заключительная концентрация была достигнута на Minicon В15. Это экстракт был сохранен при -20°C. Синовиальная жидкость из колена была собрана с помощью пункции коленного сустава от пациентов с ревматическим артритом, центрифугирована при 300 g в течение 10 минут при 4°C, и сохранена при -80°C.

Электрофоретические исследования

Множественные формы ГК были изучены техникой зимограммы, используя 5%-ый полиакриламид 20 мкг/мл гиалуронановый гель (ГК-ПААГ). В некоторых случаях мы использовали другие концентрации полиакриламида, но концентрация ГК всегда была той же самой. Принцип метода – в том, что ГК высокой молекулярной массы, включенный в гель, не может переместиться в электрическую область. Электрофорез был выполнен при pH 8.3, в условиях, когда гиалуронидазы являются инактивированными. Также гели были протестированы при pH 3.5 и при 37°C, чтобы позволить пройти деградации ГК. Затем, гели были покрашены с "Stains all" в темноте и отмыты водой. Деятельность гиалуронидаз была показана прозрачными розовыми пятнами на синем фоне неразрушенного гиалуронана. Быстро двигающееся белое пятно наблюдалось в сыворотке электрофоретического образца, соответствуя богатому сиаловой кислотой гликопротеину, никак не связанному с деятельностью гиалуронидаз.

Обработка сиалидазой человеческой сыворотки и гиалуронидазы тканей

Метод десиализации был выполнен, как описано ранее. Затем использовалась техника зимограммы ГК-ПААГ.

Потенциальные участки N-гликозилирования гиалуронидазами

Гиалуронидазная аминокислотная последовательность была выровнена с помощью множественной программы выравнивания CLUSTAL W (1.74). Потенциальные участки N-гликозилирования были найдены в базе данных PROSITE. Человеческие гиалуронидазные последовательности сравнения были Hyal-1 (плазма), Hyal-2 (лизосомы), Hyal-3, Hyal-4, Hyal-мн, PH-20 (сперма) (номера вступления в GenBank U96078, AJ00099, AF36035, AF09010, AF51769 и S67798 соответственно) и менингиомы (номер вступления SwissProt AF36144). Мышиные гиалуронидазные последовательности сравнения были Hyal-1 (плазма) и Hyal-2 (лизосомы) (номера вступления GenBank AF11567 и AJ00059) и PH-20 (сперма) (номер вступления SwissProt P48794). Крысиная лизосомальная гиалуронидаза Hyal-2 (номер вступления SwissProt AF34218), гиалуронидаза печени лягушки Hyal-2 (номер вступления SwissProt AF134981). Для обезьяны вида Cynomolgus, морской свинки, кролика и лисиной гиалуронидазной последовательности PH-20 были номера вступления SwissProt соответственно P38568, P23613, P38566, U41412. Для ос, белоглазых шершней и гиалуронидаз из яда пчелы медоносной сравненные последовательности были с номерами вступления SwissProt соответственно P49370, P49371 и Q08169, а для Caenorhabditis elegans с номером вступления SwissProt Z49071.

Результаты и обсуждение

Номенклатура, используемая здесь Hyal-t, относится к гиалуронидазам в телесных, соматических тканях. Различные группы гиалуронидазной активности были распределены согласно уменьшающейся анодной подвижности групп фермента печени, начиная с самой высокой анодной подвижностью, являющейся 1.

Иллюстрация 1 показывает образцы, проанализированные на 5%-ой 20 мкг/мл ГК-ПААГ. Дорожки: (a) показаны 7 активных форм печени, самая активная из всех называется Hyal-t2-4, (b) показан образец плаценты, подобный тому из печени, но самые активные формы были связаны с более медленно движущимися группами, Hyal-t5-7. Образцы из яичников, груди, кожи, лейкоцитов и тромбоцитов показали характерные особенности для каждой ткани. Сыворотка и синовиальная жидкость показали единичную отдельную группу. Относительно мочи не мог быть сделан никакой ясный вывод, поскольку различия между людьми в зависимости от физиологических и патологических условий могли бы повлиять на результаты.

Иллюстрация 2 указывает, что сыворотка показывает три формы на 6%-ом 20 мкг/мл ГК-ПААГ. Наблюдаемый гиалуронидазный полиморфизм может произойти из-за различных степеней сиализации. Чтобы исследовать этот пункт десиализации в случае с сиалидазой холерного вибриона с её широкой специфичностью на терминальную сиаловую кислоту гликопротеинов, была выполнен анализ зимограммы.

Иллюстрация 3 показывает электрофоретические образцы на 7%-ом 20 мкг/мл ГК-ПААГ человеческих гиалуронидаз от сыворотки (a, b), печени (c, d) и плаценты (e, f) после 5 и 180 минутной инкубации с сиалидазой. Десиализированные гиалуронидазные формы из сыворотки мигрируют более медленно, чем передача десиализированных форм от печени и плаценты. Десиализированные гиалуронидазы печени и плаценты выставляют на обозрение три и две электрофоретических формы соответственно. Молекулярная масса нативной человеческой гиалуронидазы в сыворотке и в грудной ткани является 67 кДа. Здесь мы показали, что молекулярная масса десиализированных форм сыворотки и плацентарной гиалуронидазы была 110 кДа. Молекулярная масса десиализированных гиалуронидаз, оказавшаяся выше ожидаемой, может быть объяснена формированием димеров, возможно из-за агрегирования в отсутствии отрицательных зарядов сиаловых кислот.

Тепловые профили стабильности нативной гиалуронидазы от сыворотки и плаценты идентичны. Активность этих ферментов была устойчива до 46°C. Однако, после обработки сиалидазой и нагрева до 45°C, гиалуронидазная сыворотка сохраняет 80% ее начальной активности, в то время, как плацентарная гиалуронидаза сохраняет только 10%. Так как гликозилирование защищает гликопротеины от тепловой денатурации, сывороточная гиалуронидаза могла бы не только более сиализованной, но может также иметь более высокое полное содержание сахаров.

Гиалуронидазные консервативные потенциальные участки N-гликозилирования

Потенциальные участки N-гликозилирования разыскивались в аминокислотных последовательностях гиалуронидаз человека и других видов живых существ. Потенциальные участки N-гликозилирования в гликопротеинах являются специфичными определенными аминокислотными последовательностями Asn-Xaa-Ser/Thr. Однако, присутствие этого трипептида ещё не условие, чтобы заключить, что остаток аспарагина гликозилирован, так как сворачивание белка играет важную роль в регулировании N-гликозилирования.

При сравнении человеческих гиалуронидазных аминокислот выравнивания плазмы (Hyal-1), лизосом (Hyal-2), Hyal-4 и Hyal-мн наблюдалось присутствие потенциального участка N-гликозилирования с подобными трипептидными образцами в том же самом местоположении (участок 1). Согласно таблице 1, тот же самый участок также присутствовал в сыворотке мыши и ее лизосомах, в лизосомах крысы, в печени лягушки, у ос, шершней, вяде пчелы медоносной и в С.elegans. Этот участок отсутствовал в человеческом Hyal-3 и ы человеческой менингиоме, а также во всех изученных образцах спермы (PH-20). Второй потенциальный участок N-гликозилирования наблюдался в ином местоположении далее в полипептидной цепи, образец - Asn-Val-Thr для нелизосомальных гиалуронидаз всех видов, относящихся к млекопитающим, определен так же, как для печени лягушки. В контрасте с этим гиалуронидазы лизосомального происхождения указывают на трипептидный образец Asn-Val-Ser. Этот участок присутствует у осы и в яде шершня и отсутствует в яде пчелы медоносной и в C. elegans.

Виды

Гиалуронидазы Участок l Участок 2
Человек

Плазма (Hyal-1)

Лизосомы (Hyal-2)

Hyal-3

Hyal-4

Hyal-мн

Менингиома

Сперма (PH-20)

99Asn-Ala-Ser

103Asn-Val-Ser

115Asn-Ile-Ser

103Asn-Val-Ser

350 Asn-Val-Thr

356 Asn-Val-Ser

348 Asn-Val-Thr

348 Asn-Val-Thr

356 Asn-Val-Thr

358 Asn-Val-Ser

368 Asn-Val-Thr

Мышь Плазма (Hyal-1)Лизосомы (Hyal-2) Сперма (PH-20) 127Asn-Ala-Ser 103Asn-Gly-Ser 378Asn-Val-Thr 356Asn-Val-Ser 368Asn-Val-Thr

 

Крыса
Лизосомы (Hyal-2) 103Asn-Gly-Ser 356Asn-Val-Ser
Лягушка Печень (Hyal-2) 104Asn-Glu-Thr 372Asn-Val-Thr
Cunomolgus (обезьяна) Сперма (PH-20)   372Asn-Val-Thr
Морская свинка Сперма (PH-20)   368Asn-Val-Thr
Кролик Сперма (PH-20)   368Asn-Val-Thr
Лиса Сперма (PH-20)   368Asn-Val-Thr
Оса Яд 99Asn-Glu-Ser 325Asn-Val-Thr
Шершень Яд 79Asn-Ile-Thr 325Asn-Val-Thr
Пчела медоносная Яд 115Asn-Leu-Thr  
C. elegans   119Asn-Glu-Thr  

Таблица 1. Гиалуронидазные консервативные потенциальные участки N-гликозилирования

Заключение

Различия между множественными изоформами человеческих гиалуронидаз не только связаны с их аминокислотными последовательностями, но также и с их структурой гликозилирования. Гиалуронидазы от различных видов и из органов разного происхождения обладают в своих аминокислотных последовательностях консервативными подобными/идентичными потенциальными участками N-гликозилирования.